К неоспоримым преимуществам метода полимеразной цепной реакции относятся следующие аспекты. ПЦР диагностика является быстрым и точным методом исследования, когда невозможно вывить возбудителя другими методами. ПЦР расшифровывается как «полимеразная цепная реакция». Это метод лабораторной диагностики, цель которого заключается в выявлении возбудителя инфекционного заболевания. К неоспоримым преимуществам метода полимеразной цепной реакции относятся следующие аспекты.
История открытия и разработка метода пцр
- ПЦР или ИФА: что лучше, отрицательно, положительно, чем отличается
- Диагностика COVID-19: обзор основных методов
- Как часто сдавать ПЦР анализ на ЗППП если ничего не беспокоит?
- Полимеразная цепная реакция — Википедия
Полимеразная цепная реакция: как одна технология изменила мир?
- Что такое анализ ПЦР? - статья лаборатории ДНКОМ
- Преимущества метода ПЦР
- СВЯЗАТЬСЯ С РЕДАКЦИЕЙ
- Что такое ПЦР-тест? Методика, преимущества и недостатки анализа | РИА Новости | Дзен
- ПЦР-исследования
- Отечественные решения для автоматизации и цифровизации ПЦР-исследований — PCR News
Принципы ПЦР-диагностики
Сравнение идет сразу по шести мутациям патогена. В организации отметили повышенную скорость его распространения, более высокий риск тяжелого течения заболевания и пониженную восприимчивость к антителам. Поэтому понимать, каким именно штаммом заражены больные, важно для улучшения мониторинга распространения новой версии коронавируса. Тест включает в себя праймеры и зонды — короткие фрагменты одноцепочечной ДНК. Они подобраны таким образом, чтобы взаимодействовать в пробирке с генетическим материалом коронавируса только при условии полного совпадения последовательностей. Каждая пара праймеров и зонда несет в себе либо мутацию геноварианта «Дельта», либо мутацию «Омикрона». Если система срабатывает, значит, в генетическом материале эта конкретная мутация есть. Основу процесса исследования составляет метод ПЦР в реальном времени, который зарекомендовал себя как очень быстрый и чувствительный способ, подчеркивают в Роспотребнадзоре.
Набор включает в себя две мутации, характерные для «Дельты», и четыре — для «Омикрона».
Особенности ПЦР — альтернатива клонированию для получения, в сущности, неограниченных количеств интересующей ДНК-последовательности. ПЦР за несколько часов может избирательно увеличить в количестве единственную молекулу ДНК до нескольких миллионов копий, что революционизировало как молекулярную диагностику, так и молекулярный анализ генетических болезней. ПЦР — ферментативное «умножение» или амплификация фрагмента ДНК, расположенного между двумя олигонуклеотидами, так называемыми праймерами. Праймеры разрабатывают таким образом, что первый комплементарен одной нити молекулы ДНК с одной стороны целевой последовательности, а второй — другой нити противоположной стороны этой же последовательности. Затем, используя последовательность между праймерами как шаблон, с помощью ДНК-полимеразы синтезируются две новые нити ДНК. Вновь синтезированные комплементарные нити ДНК формируют следующую копию исходной целевой последовательности. Регулярные циклы тепловой денатурации, гибридизации праймеров и ферментативного синтеза ДНК приводят к экспоненциальному росту 2, 4, 8,16, 32,...
Они несут в себе способность синтезировать и выделять необходимые антитела. Однако в пробирке эти клетки существуют лишь несколько дней. Образовавшийся при слиянии двух клеток гибрид наследует признаки обоих «родителей». К настоящему времени получены тысячи разнообразных МАТ, несколько тысяч гибридом, в т. Преимущества МАТ: Главная особенность МАТ — чрезвычайная моноспецифичность против одной антигенной детерминанты и абсолютная однородность. Возможность многократного получения в течение длительного времени воспроизводимость. Неограниченное количество получаемых антител. По специфичности и чувствительности МАТ достигают значений, предельных для живой природы. Отсюда возможность использования для анализа антигенов не высокой степени чистоты. Метод ИФА находится в постоянном развитии. С одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой - углубляются и совершенствуются методы самого анализа. Это приводит к тому, что упрощается схема анализа, сокращается время его проведения, уменьшается расход реагентов. Идет постоянный поиск все новых и новых веществ, используемых в качестве маркеров. Все возрастающее влияние на ИФА оказывают химия высокомолекулярных соединений, клеточная и генная инженерия, под влиянием которых меняются технологии получения реагентов для ИФА. Еще одним из важнейших современных методов диагностики заболеваний внутренних органов является ДНК-диагностика методом полимеразной цепной реакции. ПЦР позволяет найти в исследуемом материале небольшой участок генетической информации, заключенный в специфической последовательности нуклеотидов ДНК любого организма среди огромного количества других участков ДНК и многократно размножить его. ПЦР — это циклический процесс, в каждом цикле которого происходит тепловая денатурация двойной цепи ДНК-мишени, последующее присоединение коротких олигонуклеотидов-праймеров и наращивание их с помощью ДНК-полимеразы путем присоединения нуклеотидов. В результате накапливается большое количество копии исходной ДНК-мишени, которые легко подаются детекции. Открытию полимеразной цепной реакции сопутствовало развитие молекулярно-биологических технологий. Первые данные о химических своиствах ДНК появились в 1868 г. К началу 50-годов ХХ в. Основания бывают двух типов: пуриновые — аденин и гуанин и пиримидиновые — цитозин и тимин. В 1953 г. Уотсон и Ф. Крик пришли к выводу, что нативная ДНК состоит из двух комплиментарных полимерных цепей, образующих двойную спираль. Согласно модели Уотсона навитые одна на другую цепи удерживаются вместе водородными связями, образующимися между комплементарными основаниями противоположных цепей. При этом аденин образует пару только с тимином, а гуанин — с цитозином. Каждая цепь служит матрицей при синтезе новой цепи, а последовательность в синтезируемой растущей цепи задается последовательностью комплементарных оснований цепи-матрицы. В 1955 г. Корнберг открыл в клетках фермент, который назвал ДНК-полимеразой.
Именно этот фермент катализирует и "контролирует" все процессы во время проведения анализа методом ПЦР. Особенность этого фермента - он термостабилен, исключительно термостоек: он выдерживает нагревание до температуры кипения без потери активности, а "любимый" его температурный режим во время работы - 72оС. Многие реакции при проведении ПЦР идут почти исключительно при повышенной температуре. С момента появления метода, ПЦР-исследования завоевывают все большую и большую популярность. Ее принципиальной особенностью является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет избежать ошибок и ложноположительных результатов, связанных с контаминацией и значительно ускорить получение результата. ПЦР в реальном времени использует флуоресцентно меченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации.
Цепная реакция. Как работают тесты на коронавирус?
При диагностике туберкулёза метод ПЦР применяют в случае получения положительных резуль-татов при проведении плановых аллергических исследований в благополучных по туберкулёзу хозяй-ствах. Молекулярно-биологические исследования с применением метода полимеразной цепной реакций (ПЦР). Метод ПЦР был признан обязательным методом ускоренной диагностики для индикации и лабораторной диагностики возбудителей инфекционных болезней бактериальной и вирусной этиологии в клиническом материале и пробах из объектов окружающей среды.
Что такое ПЦР-тест? Методика, преимущества и недостатки анализа
| Как проводят анализ методом ПЦР: описание процедуры | К неоспоримым преимуществам метода полимеразной цепной реакции относятся следующие аспекты. |
| Диагностика ВИЧ: методы и исследования | Анализ — полимеразная цепная реакция имеет аббревиатуру — ПЦР. |
| Микробиологические исследования | диагностика) считается одним из самых современных и точных методов молекулярной диагностики различных инфекций, в том числе урологических и гинекологических заболеваний. |
| ПЦР-анализ: что это такое, когда он назначается и как проводится? | Методика проведения анализа с использованием метода ПЦР включает три этапа. |
| ПЦР анализ – что это такое, как делают ПЦР анализ крови. | В середине 1990-х с помощью метода ПЦР-амплификации ДНК исследовали останки царской семьи Романовых. |
ПЦР: сверхчувствительная диагностика инфекций
FRT Manager позволяет получать и печатать результаты в формате лабораторного журнала, индивидуальных бланков для пациентов или выгружать все данные в ЛИС. Докладчик отметил, что это еще неполная автоматизация и цифровизация, так как она затрагивает только один из шагов — ПЦР-амплификацию. С одной стороны, он учитывает и автоматизирует техническую составляющую лаборатории — методы экстракции, имеющееся оборудование, используемые наборы реагентов. С другой стороны, программа держит в своих настройках тип биоматериала и направления на исследования, на основе чего составляет и выдает рабочее задание для персонала и оборудования. Когда образцы поступают в лабораторию, с них сканером штрих-кодов считываются данные, обрабатываются, и на этап экстракции формируется задание для сотрудников. Они устанавливают часть проб в станции выделения, а с другими работают вручную. После экстракции генерируется задание для амплификаторов, сотрудник загружает планшеты или пробирки и запускает прибор.
Для повышения точности и достоверности результатов ПЦР-исследования и их однозначного толкования в лабораторной диагностике, так же, как и в научных экспериментах, используют ряд контрольных экспериментов реакций. Помимо стандартных положительной и отрицательной контрольных реакций, в ПЦР-диагностике используют внутренний контрольный образец ВКО. Использование ВКО основано на возможности проведения в одной реакционной смеси нескольких практически независимых реакций амплификации для разных фрагментов ДНК мультиплексная ПЦР. Так, например, для контроля за эффективностью ПЦР можно использовать одновременное протекание двух реакций амплификации в одной пробирке. С помощью ВКО, добавляемого в образец перед этапом пробоподготовки очистки ДНК от примесей , можно проконтролировать эффективность всех этапов анализа. Специалисты знают, что очень важным этапом разработки ПЦР-тест-системы является правильная разработка и использование ВКО внутреннего контрольного образца. В случае ОТ-ПЦР ПЦР с предшествующей ей обратной транскрипцией ВКО — это специально сконструированный препарат РНК экзогенный внутренний контроль , добавленный к каждому исследуемому образцу на этапе пробоподготовки биологического материала или изначально содержащийся в биологическом материале эндогенный внутренний контроль , который проходит через все стадии ПЦР-анализа.
Например, туда могут быть включены дополнительные типы вируса герпеса или папилломовируса, тогда анализ будет называться «ПЦР 13» или «ПЦР 14». Иногда перечень, наоборот, сокращается до «ПЦР 4» гонорея-трихомониаз-хламидиоз-микоплазмоз. ПЦР качественная и ПЦР количественная У этих двух видов ПЦР-диагностики принципиально разные цели: качественный анализ даёт ответ на вопрос, имеется ли вообще у пациента искомый микроб, то есть просто «да» или «нет». Только что рассмотренный комплекс ПЦР 12 относится как раз к этой категории. Но существует ещё количественный анализ, или ПЦР в режиме реального времени. Метод основывается на том, что число новых ампликонов копий заданного участка ДНК возбудителя болезни прямо пропорционально их исходному количеству. То есть если в пробе с самого начала было много вредоносных молекул ДНК, то с каждым циклом полимеразной цепной реакции их будет становиться вдвое больше, а к концу процесса накопятся миллионы. Современные приборы амплификаторы следят за тем, как меняется количество копий, и по итогам исследования вычисляют примерную концентрацию возбудителя в организме пациента. Для чего это нужно? В случае с бактериями, простейшими или грибками подобные сведения имеют спорную диагностическую ценность, поскольку численность колоний постоянно меняется под воздействием самых разных факторов, да и уничтожить такие микроорганизмы сравнительно просто. Другое дело — вирус. Это неклеточная форма жизни, которую невозможно истребить подобно тому, как антибиотики справляются с бактериями. В борьбе с вирусами человек может твёрдо рассчитывать только на свой иммунитет, а возможности противовирусных средств сильно ограничены. Именно когда дело касается вирусов, становится особенно актуальной методика ПЦР в режиме реального времени. Вирусная нагрузка или виремия — это степень тяжести поражения организма вирусом. Показатель рассчитывается путём определения числа вирионов в биологическом материале, измеряется в МЕ или в количестве копий на 1 мл крови и служит для контроля над ходом терапии и предупреждения распространения вируса. Но и в случае с другими вирусами определение нагрузки может оказаться полезным — например, когда речь идёт о цитомегаловирусе, герпесе или папилломовирусе.
Изначально метод использовался в основном для научных целей, но затем, разглядев его перспективность и эффективность, метод стали продвигать в практическую медицину. Кэри Мюллис. В принципе, очень точное описание. Если продолжать сравнение, то игла — это небольшой участок генетического материала микроорганизма, а стог сена — это организм человека, в котором данный микроорганизм поселился. Что показывает анализ ПЦР Анализ позволяет обнаружить присутствие генетического материала инфекционных возбудителей. ПЦР в гинекологии и в урологии широко применяется для выявления скрытых и труднодиагностируемых инфекций. Принцип работы За генетическую информацию в живом организме любого размера отвечает ДНК — двухспиральная дезоксирибонуклеиновая кислота, состоящая из последовательности четырех нуклеотидов, которые принято обозначать буквами А аденин , Г гуанин , Т тимидин и Ц цитозин. Одно из основных правил генетики — правило комплементарности, то есть нуклеотиды соседних спиралей ДНК соединяются только в определеном порядке: А с Т, Г с Ц, и никак иначе. Рисунок 1. Схема трех стадий полимеразной цепной реакции. Некоторые виды микроорганизмов, например, вирус иммунодефицита человека, хранят генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте — РНК, но и её фрагменты можно находить с помощью ПЦР. Именно на обнаружении этого небольшого, но уникального для каждого отдельного организма участка и построен принцип ПЦР. Для каждого возбудителя создан свой специфический генетический детектор, эталонный фрагмент ДНК, который по принципу комплементарности точно обнаруживает «свой» фрагмент ДНК и запускает реакцию создания огромного количества его копий. Один цикл ПЦР длится около трёх минут, количество копий растёт в геометрической прогрессии. Таким образом, за несколько часов количество фрагментов увеличивается в несколько миллиардов раз. Понятно, что теперь определить, какой возбудитель у данной конкретной инфекции, достаточно легко.
ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — важнейший лабораторный метод исследования тонкой молекулярной структуры генетического материала. 40. Исследование биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени: Методиче-ское пособие для лаборантов / Сост. Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) — метод молекулярной биологии, позволяющий создать копии определенного фрагмента ДНК из исходного образца, повысив его содержание в пробе на несколько порядков. Анализ методом ПЦР основан на обнаружении в материале исследования небольшого фрагмента ДНК возбудителя той инфекции, которую подозревает врач. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) обладает высокой специфичностью при выявлении РНК SARS-CoV-2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод молекулярно-генетической диагностики, позволяющий обнаружить в организме человека различные инфекционные заболевания.
ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — важнейший лабораторный метод исследования тонкой молекулярной структуры генетического материала. Основу процесса исследования составляет метод ПЦР в реальном времени, который зарекомендовал себя как очень быстрый и чувствительный способ, подчеркивают в Роспотребнадзоре. • При необходимости исследования единого первичного образца разными диагностическими методами первая аликвота должна отбираться для ПЦР‐анализа наконечником с фильтром.
ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции
Согласно руководству ВОЗ, анализы на коронавирус COVID-19 должны проводиться методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. Если вам назначили количественный ПЦР-анализ, врач напишет в направлении не только название исследования, но и предпочтительный метод, которым нужно провести ПЦР-анализ. Благодаря своей универсальности метод ПЦР в реальном времени используется во многих областях исследований, включая биомедицину, микробиологию, ветеринарию, сельское хозяйство, фармакологию, биотехнологию и токсикологию [4]. Методика проведения анализа с использованием метода ПЦР включает три этапа.
Что такое анализ ПЦР?
В зависимости от их размера каждая биомолекула движется по-разному через матрицу геля: маленькие молекулы легче проникают через поры в геле, в то время как более крупные имеют большую сложность. Гель обычно работает в течение нескольких часов, хотя это зависит от напряжения, приложенного к гелю; Миграция происходит быстрее при более высоких напряжениях, но эти результаты обычно менее точны, чем при более низких напряжениях. По истечении заданного времени биомолекулы мигрируют на разные расстояния в зависимости от их размера. Меньшие биомолекулы движутся дальше вниз по гелю, в то время как более крупные остаются ближе к точке происхождения. Следовательно, биомолекулы могут быть разделены примерно в соответствии с размером, который зависит в основном от молекулярной массы в денатурирующих условиях, но также зависит от конформации высшего порядка в нативных условиях. После окрашивания биомолекулы разных видов появляются в виде отдельных полос внутри геля. Для калибровки геля и определения приблизительной молекулярной массы неизвестных биомолекул путем сравнения пройденного расстояния относительно маркера обычно используют маркеры размера молекулярной массы с известной молекулярной массой на отдельной дорожке в геле. Кроме «обычного» электрофореза в пластине из геля, в некоторых случаях используют капиллярный электрофорез, который проводят в очень тонкой трубочке, наполненной гелем обычно полиакриламидным. Разрешающая способность такого электрофореза значительно выше: с его помощью можно разделять молекулы ДНК, отличающиеся по длине всего на один нуклеотид. Об одном из важных приложений такого метода читайте в описании метода секвенирования ДНК по Сэнгеру.
Элекрофорез в агарозном геле Самым популярным методом электрофореза с гелем является использование агарозного геля. Именно этот гель, как среду с определенным рН, используют в целях разделения, очищения и идентификации отдельных фрагментов ДНК. Почему эта методика стал столь популярна в современной генетике? Гель электрофорез помогает выделить и разделить фрагменты дезоксирибонуклеиновой кислоты. За счет трений материалов, образующих гель, формируется «молекулярное сито», что помогает дифференцировать молекулы в соответствии с размером и зарядом. Скорость движения заряженных частиц ДНК через образованные поры в электрическом поле зависят от нескольких факторов: Силы образованного электрического поля; Относительной степени «боязни» воды образцов; Температурной кривой буфера и ионной силы. Рисунок 18. Электрофорез в агарозном геле с использованием бромистого этидия для визуализации результатов в ультрафиолете слева. Вторая слева дорожка-маркер с известными длинами фрагментов.
Справа - Установка для проведения электрофореза в геле. Первый, наиболее часто используемый в последнее время - добавление в гель веществ флуоресцирующих, в присутствии ДНК традиционно использовался довольно токсичный бромистый этидий; в последнее время в обиход входят более безопасные вещества. Бромистый этидий светится оранжевым светом при облучении ультрафиолетом, причем при связывании с ДНК интенсивность свечения возрастает на несколько порядков. Другой метод заключается в использовании радиоактивных изотопов, которые необходимо предварительно включить в состав анализируемой ДНК. В этом случае на гель сверху кладут фотопластинку, которая засвечивается над полосами ДНК за счет радиоактивного излучения этот метод визуализации называют авторадиографией Выявление определенной последовательности ДНК в смеси. Саузерн блоттинг Рис. Саузерн-блоттинг от англ. Southern blot — метод, применяемый в молекулярной биологии для выявления определённой последовательности ДНК в образце. Метод Саузерн-блоттинга сочетает электрофорез в агарозном геле для фракционирования ДНК с методами переноса разделённой по длине ДНК на мембранный фильтр для гибридизации.
С помощью электрофореза можно узнать размер молекул ДНК в растворе, однако он ничего не скажет о последовательности нуклеотидов в них. С помощью гибридизации ДНК можно понять, какая из полос содержит фрагмент со строго определенной последовательностью. Сначала необходимо синтезировать ДНК-зонд, комплементарный той последовательности, которую мы ищем. Он обычно представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК длиной 10—1000 нуклеотидов. Из-за комплементарности зонд свяжется с необходимой последовательностью, а за счет флуоресцентной метки или радиоизотопов, встроенных в зонд, результаты можно увидеть. Для этого используют процедуру, называемую Саузерн-блоттинг или перенос по Саузерну, названную по имени ученого, ее изобретшего Edwin Southern. Первоначально смесь фрагментов ДНК разделяют с помощью электрофореза. На гель сверху кладут лист нитроцеллюлозы или нейлона, и разделенные фрагменты ДНК переносятся на него за счет блоттинга: гель лежит на губке в ванночке с раствором щелочи, который просачивается через гель и нитроцеллюлозу за счет капиллярного эффекта от бумажных полотенец, сложенных сверху. Во время просачивания щелочь вызывает денатурацию ДНК, и на поверхность пластины нитроцеллюлозы переносятся и закрепляются там уже одноцепочечные фрагменты.
Лист нитроцеллюлозы аккуратно снимают с геля и обрабатывают радиоактивно меченной ДНК-пробой, специфичной к необходимой последовательности ДНК. Лист нитроцеллюлозы тщательно отмывают, чтобы на нем остались только те молекулы пробы, которые гибридизовались с ДНК на нитроцеллюлозе. После авторадиографии ДНК, с которой гибридизовался зонд, будет видна как полосы на фотопластинке рис. Схема проведения Саузерн-блоттинга Адаптация этой методики для определения специфических последовательностей РНК называется, в противоположность Саузерн-блоттингу, норзерн-блоттингом northern blotting : southern по-английски означает «южный», а northern — «северный». Денатурирующий градиентный гель-электрофорез DGGE Выше мы рассмотрели основные принципы работы гель-электрофореза. Однако все чаще в литературе, посвященной исследованиям по секвенированию ДНК, можно встретить информацию об использовании метода ДГЭ или денатурирующего градиентного гель-электрфореза. В частности упоминается о т. Обнаружено, что определенные денатурирующие гели способны индуцировать расплавление ДНК на различных стадиях. В результате этого плавления ДНК распространяется по гелю и может быть проанализирована на отдельные компоненты, даже такие небольшие, как 200-700 пар оснований.
Уникальность метода DGGE заключается в том, что по мере того, как ДНК подвергается все более экстремальным условиям денатурации, расплавленные нити полностью распадаются на отдельные нити. Процесс денатурации на денатурирующем геле очень резкий большинство фрагментов плавятся в пошаговом процессе. Дискретные части или домены фрагмента внезапно становятся одноцепочечными в очень узком диапазоне денатурирующих условий. Это позволяет различать различия в последовательностях ДНК или мутации различных генов: различия в последовательности фрагментов одинаковой длины часто приводят к тому, что они частично плавятся в разных положениях градиента и поэтому "останавливаются" в разных положениях геля. На чем основан метод DGGE? Метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза основан на зависимости свойств плавления или денатурации небольших двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последовательности, а точнее - от соотношения А-Т- и G-C-пар в исследуемых фрагментах. Объясняется это тем, что G-C-связь более прочна по сравнению со связью между нуклеотидами А и Т. Подобные различия в динамике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвижности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при их электрофорезе в денатурирующих условиях. Градиент денатурации достигается разницей температур, различной концентрацией мочевины или формальдегида в гелях.
При этих условиях одинаковые по величине двухнитевые молекулы ДНК, отличающиеся по нуклеотидной последовательности, денатурируют по-разному. Разработан компьютерный алгоритм, позволяющий предсказывать характер плавления в зависимости от нуклеотидной последовательности. При электрофорезе амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК в геле с линейно возрастающим градиентом концентраций денатурирующих агентов плавление нитей ДНК происходит в строго специфичной для данной последовательности области, эквивалентной температуре плавления, т. После начала плавления продвижение двухнитевого фрагмента ДНК в геле резко замедляется вследствие сложной пространственной конфигурации молекул, причем эта задержка будет длиться до тех пор, пока не наступит полная денатурация ДНК. В результате происходит разделение фрагментов ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Клонирование ДНК Молекулярное клонирование - это совокупность экспериментальных методов в молекулярной биологии, которые используются для сборки рекомбинантных молекул ДНК и направления их репликации в организме хозяина. Использование слова клонирование относится к тому факту, что метод включает репликацию одной молекулы для получения популяции клеток с идентичными молекулами ДНК. Молекулярное клонирование обычно использует последовательности ДНК от двух различных организмов: вид, который является источником ДНК, подлежащей клонированию, и вид, который будет служить в качестве живого хозяина для репликации рекомбинантной ДНК. Мы уже знаем, каким образом можно разрезать геном на части а их сшивать с произвольными молекулами ДНК , разделять полученные фрагменты по длине и с помощью гибридизации выбрать необходимый.
Теперь настало время узнать, как, скомбинировав эти методы, мы можем клонировать участок генома например, определенный ген. В геноме любой ген занимает крайне маленькую длину по сравнению со всей ДНК клетки. Клонирование ДНК буквально означает создание большого числа копий определенного ее фрагмента. Именно за счет такой амплификации мы получаем возможность выделить участок ДНК и получить его в достаточном для изучения количестве. Каким образом разделить фрагменты ДНК по длине и идентифицировать нужный — было упрощенно рассказано выше. Теперь надо понять, каким образом можно копировать необходимый нам фрагмент. Клонирование определяется как процесс выделения заданной последовательности ДНК и получения многих её копий с использованием организмов здесь репликация. Основной подход предполагает использование бысто делящихся организмов чаще всего бактериальных клеток, обычно E. В нашем разделе о клонировании ДНК рассмотрим клонирование с использованием клеток бактерий E.
Процесс самой ПЦР полимеразной цепной реакции , как метод амплификаци нуклеиновых кислот in vitro рассмотрим отдельно Прим. Плазмида кодирует гены, регулирующие репликацию и контролирующие копийность 1—2 молекулы на клетку. Искусственные бактериальные хромосомы часто используются для секвенирования геномов организмов в различных проектах, например в проекте Геном человека. Короткий фрагмент ДНК исследуемого организма вставляется в хромосому, а затем амплифицируется и секвенируется. После этого прочитанные последовательности выравниваются in silico в результате чего получается полная последовательность генома организма. Сейчас такой подход был вытеснен более быстрыми и менее трудоёмкими методами секвенирования, например методом дробовика или методами секвенирования нового поколения. На рисунке - этапы BAC-клонирования фрагмента ДНК с использованием вектора плазмиды , содержащего ген lac Z изображены этапы до выделения плазмид с клонированным фрагментом рис. Этапы клонирования фрагмента ДНК с ипользованием кишечной палочки и вектора, содержащего ген lac Z все этапы см. Если вектор, содержащий такой ген, ввести в клетку E.
Исходные мутантные клетки, не содержащие b-галактозидазу, не способны к этому превращению. Следовательно, на среде с X-Gal исходные нерекомбинантные клетки будут давать белые колонии, а рекомбинантные клетки - голубые. Процесс клонирования ДНК включает следующие этапы: Получение целевых фрагментов ДНК в том числе генов или их частей с помощью ферментов рестрикции ; Выбор вектора Вектор - молекула ДНК или РНК, способная переносить включенные в нее чужеродные гены в клетку, где эти молекулы реплицируются автономно или после интеграции с геномом хромосомой. Вставка фрагмента ДНК в вектор; Введение вектора в популяцию восприимчивых клеток хозяина и трансформация с помощью вектора организма хозяина то есть поглощение бактериальной клеткой молекулы ДНК из внешней среды ; Отбор успешно трансформированной клетки обычно отбор проводят по генетическим маркерам, которыми помечен вектор. Главным образом маркерами служат гены устойчивости к антибиотикам. Поэтому отбор проводят высевом клеток на среды, содержащие конкретный антибиотик. После высева на этих средах вырастают только клетки, в составе которых находится вектор с генами антибиотиковой устойчивости ; Размножение отобранной клетки Выделение векторных молекул из клетки Выделение целевого фрагмента ДНК. Изображение этапов клонирования Рис. Схема клонирования участка ДНК гена в бактериях Поскольку при каждом клеточном делении бактерии как и другие клетки удваивают свою ДНК, это можно использовать для умножения количества необходимой нам ДНК.
Для того, чтобы внедрить наш фрагмент ДНК в бактерию, необходимо «вшить» его в специальный вектор, в качестве которого обычно используют бактериальную плазмиду небольшую относительно бактериальной хромосомы - кольцевую молекулу ДНК, реплицирующуюся отдельно от хромосомы. У бактерий «дикого типа» часто встречаются подобные структуры: они часто переносятся « горизонтально » между разными штаммами или даже видами бактерий. Чаще всего в них содержатся гены устойчивости к антибиотикам именно из-за этого свойства их и открыли или бактериофагам, а также гены, позволяющие клетке использовать более разнообразный субстрат. Иногда же они «эгоистичны» и не несут никаких функций Именно такие плазмиды обычно и используют в молекулярно-генетических исследованиях. В плазмидах обязательно содержится точка начала репликации последовательность, с которой начинается репликация молекулы , целевая последовательность рестриктазы и ген, позволяющий отобрать те клетки, которые обладают этой плазмидой обычно, это гены устойчивости к какому-нибудь антибиотику. Плазмидная карта может быть прочитана путем понимания ее особенностей, таких как название и размер плазмиды, тип элементов в плазмиде и их относительное положение, а также ориентация промотора. В плазмиду с помощью рестриктаз и лигаз встраивают необходимый фрагмент ДНК, после чего добавляют ее в культуру бактерий при специальных условиях, обеспечивающих трансформацию — процесс активного захвата бактерией ДНК из внешней среды риc. После этого проводят отбор бактерий, трансформация которых прошла успешно, добавляя соответствующий гену в плазмиде антибиотик: в живых остаются только клетки, несущие ген устойчивости а, следовательно, и плазмиду. Далее, после роста культуры клеток, из нее выделяют плазмиды, а из них с помощью рестриктаз выделяют «наш» фрагмент ДНК или используют плазмиду целиком.
В настоящее время почти исключительно используются полиакриламидные гели ПААГ и гели агарозы. Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость. Но есть, разумеется, и свои проблемы. Разделяемые макромолекулы все же находятся в растворе, поэтому возможна их диффузия, приводящая к размыванию зон. Это тем более серьезно, что протекание через жидкость электрического тока неизбежно связано с выделением тепла. К счастью, крупные молекулы нуклеиновых кислот диффундируют не слишком быстро. Для визуализации результатов электрофореза проводят окрашивание зон путем вымачивания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют, а гель облучают ультрафиолетом, под действием которого связавшийся с двунитевой ДНК краситель флуоресцирует.
А Электрофорез в полиакриламидном геле Рис. Электрофорез в полиакриламидном геле чаще используется для белков Электрофорез в полиакриламидном геле ПААГ или PAGE - метод, широко используемый для разделения биологических макромолекул в соответствии с их электрофоретической подвижностью. Подвижность является функцией длины, конформации и заряда молекулы. Как и во всех формах гель-электрофореза, молекулы могут работать в своем естественном состоянии, сохраняя структуру молекул более высокого порядка, или может быть добавлен химический денатурант, чтобы удалить эту структуру и превратить молекулу в неструктурированную линейную цепь, подвижность которой зависит только от ее длины и отношение массы к заряду. Таким образом, разделяют т. Базовые приготовления Образцы могут представлять собой любой материал, содержащий белки. Они могут быть получены биологически, например, из прокариотических или эукариотических клеток, тканей, вирусов, проб окружающей среды или очищенных белков. Образец для анализа необязательно смешивают с химическим денатурантом, обычно SDS для белков. SDS - это анионный детергент, который денатурирует вторичные и недисульфидно-связанные третичные структуры и дополнительно придает отрицательный заряд каждому белку пропорционально его массе. Приготовление акриламидных гелей Гели обычно состоят из акриламида, бисакриламида, необязательного денатурирующего вещества SDS и буфера с отрегулированным pH.
Раствор можно дегазировать под вакуумом, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха во время полимеризации. Источник свободных радикалов и стабилизатор, такой как персульфат аммония и TEMED, добавляются для инициирования полимеризации. Реакция полимеризации создает гель из-за добавленного бисакриламида, который может образовывать поперечные связи между двумя молекулами полиакриламида. Гели, как правило, полимеризуются между двумя стеклянными пластинами в гелеобразователе, с гребнем, вставленным вверху для создания лунок для образца. После того, как гель полимеризован, «расческа» может быть удалена, и гель готов для электрофореза. Электрофорез В PAGE используются различные буферные системы в зависимости от природы образца и цели эксперимента. Буферы, используемые на аноде и катоде, могут быть одинаковыми или разными. Электрическое поле воздействует на гель, заставляя отрицательно заряженные белки мигрировать через гель от отрицательного электрода катода к положительному электроду аноду. В зависимости от их размера каждая биомолекула движется по-разному через матрицу геля: маленькие молекулы легче проникают через поры в геле, в то время как более крупные имеют большую сложность. Гель обычно работает в течение нескольких часов, хотя это зависит от напряжения, приложенного к гелю; Миграция происходит быстрее при более высоких напряжениях, но эти результаты обычно менее точны, чем при более низких напряжениях.
По истечении заданного времени биомолекулы мигрируют на разные расстояния в зависимости от их размера. Меньшие биомолекулы движутся дальше вниз по гелю, в то время как более крупные остаются ближе к точке происхождения. Следовательно, биомолекулы могут быть разделены примерно в соответствии с размером, который зависит в основном от молекулярной массы в денатурирующих условиях, но также зависит от конформации высшего порядка в нативных условиях. После окрашивания биомолекулы разных видов появляются в виде отдельных полос внутри геля. Для калибровки геля и определения приблизительной молекулярной массы неизвестных биомолекул путем сравнения пройденного расстояния относительно маркера обычно используют маркеры размера молекулярной массы с известной молекулярной массой на отдельной дорожке в геле. Кроме «обычного» электрофореза в пластине из геля, в некоторых случаях используют капиллярный электрофорез, который проводят в очень тонкой трубочке, наполненной гелем обычно полиакриламидным. Разрешающая способность такого электрофореза значительно выше: с его помощью можно разделять молекулы ДНК, отличающиеся по длине всего на один нуклеотид. Об одном из важных приложений такого метода читайте в описании метода секвенирования ДНК по Сэнгеру. Элекрофорез в агарозном геле Самым популярным методом электрофореза с гелем является использование агарозного геля. Именно этот гель, как среду с определенным рН, используют в целях разделения, очищения и идентификации отдельных фрагментов ДНК.
Почему эта методика стал столь популярна в современной генетике? Гель электрофорез помогает выделить и разделить фрагменты дезоксирибонуклеиновой кислоты. За счет трений материалов, образующих гель, формируется «молекулярное сито», что помогает дифференцировать молекулы в соответствии с размером и зарядом. Скорость движения заряженных частиц ДНК через образованные поры в электрическом поле зависят от нескольких факторов: Силы образованного электрического поля; Относительной степени «боязни» воды образцов; Температурной кривой буфера и ионной силы. Рисунок 18. Электрофорез в агарозном геле с использованием бромистого этидия для визуализации результатов в ультрафиолете слева. Вторая слева дорожка-маркер с известными длинами фрагментов. Справа - Установка для проведения электрофореза в геле. Первый, наиболее часто используемый в последнее время - добавление в гель веществ флуоресцирующих, в присутствии ДНК традиционно использовался довольно токсичный бромистый этидий; в последнее время в обиход входят более безопасные вещества. Бромистый этидий светится оранжевым светом при облучении ультрафиолетом, причем при связывании с ДНК интенсивность свечения возрастает на несколько порядков.
Другой метод заключается в использовании радиоактивных изотопов, которые необходимо предварительно включить в состав анализируемой ДНК. В этом случае на гель сверху кладут фотопластинку, которая засвечивается над полосами ДНК за счет радиоактивного излучения этот метод визуализации называют авторадиографией Выявление определенной последовательности ДНК в смеси. Саузерн блоттинг Рис. Саузерн-блоттинг от англ. Southern blot — метод, применяемый в молекулярной биологии для выявления определённой последовательности ДНК в образце. Метод Саузерн-блоттинга сочетает электрофорез в агарозном геле для фракционирования ДНК с методами переноса разделённой по длине ДНК на мембранный фильтр для гибридизации. С помощью электрофореза можно узнать размер молекул ДНК в растворе, однако он ничего не скажет о последовательности нуклеотидов в них. С помощью гибридизации ДНК можно понять, какая из полос содержит фрагмент со строго определенной последовательностью. Сначала необходимо синтезировать ДНК-зонд, комплементарный той последовательности, которую мы ищем. Он обычно представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК длиной 10—1000 нуклеотидов.
Из-за комплементарности зонд свяжется с необходимой последовательностью, а за счет флуоресцентной метки или радиоизотопов, встроенных в зонд, результаты можно увидеть. Для этого используют процедуру, называемую Саузерн-блоттинг или перенос по Саузерну, названную по имени ученого, ее изобретшего Edwin Southern. Первоначально смесь фрагментов ДНК разделяют с помощью электрофореза. На гель сверху кладут лист нитроцеллюлозы или нейлона, и разделенные фрагменты ДНК переносятся на него за счет блоттинга: гель лежит на губке в ванночке с раствором щелочи, который просачивается через гель и нитроцеллюлозу за счет капиллярного эффекта от бумажных полотенец, сложенных сверху. Во время просачивания щелочь вызывает денатурацию ДНК, и на поверхность пластины нитроцеллюлозы переносятся и закрепляются там уже одноцепочечные фрагменты. Лист нитроцеллюлозы аккуратно снимают с геля и обрабатывают радиоактивно меченной ДНК-пробой, специфичной к необходимой последовательности ДНК. Лист нитроцеллюлозы тщательно отмывают, чтобы на нем остались только те молекулы пробы, которые гибридизовались с ДНК на нитроцеллюлозе. После авторадиографии ДНК, с которой гибридизовался зонд, будет видна как полосы на фотопластинке рис. Схема проведения Саузерн-блоттинга Адаптация этой методики для определения специфических последовательностей РНК называется, в противоположность Саузерн-блоттингу, норзерн-блоттингом northern blotting : southern по-английски означает «южный», а northern — «северный». Денатурирующий градиентный гель-электрофорез DGGE Выше мы рассмотрели основные принципы работы гель-электрофореза.
Однако все чаще в литературе, посвященной исследованиям по секвенированию ДНК, можно встретить информацию об использовании метода ДГЭ или денатурирующего градиентного гель-электрфореза. В частности упоминается о т. Обнаружено, что определенные денатурирующие гели способны индуцировать расплавление ДНК на различных стадиях. В результате этого плавления ДНК распространяется по гелю и может быть проанализирована на отдельные компоненты, даже такие небольшие, как 200-700 пар оснований. Уникальность метода DGGE заключается в том, что по мере того, как ДНК подвергается все более экстремальным условиям денатурации, расплавленные нити полностью распадаются на отдельные нити. Процесс денатурации на денатурирующем геле очень резкий большинство фрагментов плавятся в пошаговом процессе. Дискретные части или домены фрагмента внезапно становятся одноцепочечными в очень узком диапазоне денатурирующих условий. Это позволяет различать различия в последовательностях ДНК или мутации различных генов: различия в последовательности фрагментов одинаковой длины часто приводят к тому, что они частично плавятся в разных положениях градиента и поэтому "останавливаются" в разных положениях геля. На чем основан метод DGGE? Метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза основан на зависимости свойств плавления или денатурации небольших двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последовательности, а точнее - от соотношения А-Т- и G-C-пар в исследуемых фрагментах.
Объясняется это тем, что G-C-связь более прочна по сравнению со связью между нуклеотидами А и Т. Подобные различия в динамике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвижности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при их электрофорезе в денатурирующих условиях. Градиент денатурации достигается разницей температур, различной концентрацией мочевины или формальдегида в гелях. При этих условиях одинаковые по величине двухнитевые молекулы ДНК, отличающиеся по нуклеотидной последовательности, денатурируют по-разному. Разработан компьютерный алгоритм, позволяющий предсказывать характер плавления в зависимости от нуклеотидной последовательности. При электрофорезе амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК в геле с линейно возрастающим градиентом концентраций денатурирующих агентов плавление нитей ДНК происходит в строго специфичной для данной последовательности области, эквивалентной температуре плавления, т. После начала плавления продвижение двухнитевого фрагмента ДНК в геле резко замедляется вследствие сложной пространственной конфигурации молекул, причем эта задержка будет длиться до тех пор, пока не наступит полная денатурация ДНК. В результате происходит разделение фрагментов ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Клонирование ДНК Молекулярное клонирование - это совокупность экспериментальных методов в молекулярной биологии, которые используются для сборки рекомбинантных молекул ДНК и направления их репликации в организме хозяина. Использование слова клонирование относится к тому факту, что метод включает репликацию одной молекулы для получения популяции клеток с идентичными молекулами ДНК.
Молекулярное клонирование обычно использует последовательности ДНК от двух различных организмов: вид, который является источником ДНК, подлежащей клонированию, и вид, который будет служить в качестве живого хозяина для репликации рекомбинантной ДНК. Мы уже знаем, каким образом можно разрезать геном на части а их сшивать с произвольными молекулами ДНК , разделять полученные фрагменты по длине и с помощью гибридизации выбрать необходимый. Теперь настало время узнать, как, скомбинировав эти методы, мы можем клонировать участок генома например, определенный ген. В геноме любой ген занимает крайне маленькую длину по сравнению со всей ДНК клетки. Клонирование ДНК буквально означает создание большого числа копий определенного ее фрагмента. Именно за счет такой амплификации мы получаем возможность выделить участок ДНК и получить его в достаточном для изучения количестве. Каким образом разделить фрагменты ДНК по длине и идентифицировать нужный — было упрощенно рассказано выше. Теперь надо понять, каким образом можно копировать необходимый нам фрагмент. Клонирование определяется как процесс выделения заданной последовательности ДНК и получения многих её копий с использованием организмов здесь репликация. Основной подход предполагает использование бысто делящихся организмов чаще всего бактериальных клеток, обычно E.
Перлман для детекции IgG фракции иммуноглобулинов, К. Ван Веемен и А. Шурс для обнаружения эстрогенов.
Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции. Основными требованиями, предъявляемыми к твердой фазе при проведении ИФА, являются устойчивость к растворам, используемым в реакции, и высокая специфическая емкость т. Наиболее распространенным способом иммобилизации антител или антигенов является адсорбция, процесс, при котором часть молекул за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а также образования водородных связей, присоединяется к поверхности твердой фазы.
В качестве твердой фазы в большинстве коммерческих диагностических наборов используют полистироловые 96-ти луночные планшеты или полистироловые шарики. Для ферментативной метки коньюгата могут быть применены разнообразные ферменты: пероксидаза хрена, щелочная фосфотаза, бета-галактозидаза, глюкозооксидаза и др. В качестве субстратного реагента также применяются разнообразные хромогенные вещества, продукты окисления которых как раз и регистрируются фотометрически при определенных длинах волн волновой диапазон 340-750 нм.
Широкое использование стандартной конфигурации 96-луночного планшета позволило унифицировать оборудование, необходимое для проведения иммуноферментного анализа. В 1972 г. Рубенштейн с сотр.
Метод получил название гомогенного ИФА и был основан на учете различий каталитических свойств ферментной метки в свободном виде и в иммунохимическом комплексе. В дальнейшем термин «гомогенный иммуноанализ» стал применим к любой системе иммуноанализа, в которой специфическая реакция взаимодействия антигена с антителом и определение глубины ее протекания осуществляются в гомогенном растворе. Отсутствие стадии разделения свободного и меченого анализируемого соединения привело к сокращению времени проведения анализа до нескольких минут.
Это исключительно важное обстоятельство позволило разработать диагностические иммуноферментные тест-системы экспресс-определения биологически активных соединений, нашедшие широкое применение в химической токсикологии, фармакологии, эндокринологии. Основной принцип ИФА — специфическое связывание антитела с мишенью. Для получения антител первоначально использовали иммунизацию животных обычно кролика очищенным белком.
Однако в этом случае получали смесь антител к разным антигенным детерминантам молекулы-мишени. Такую смесь антител называют поликлонильным препаратом. Использование поликлональных антител имело два существенных недостатка: 1 содержание отдельных антител в поликлональном препарате может варьировать от одной партии к другой; 2 поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо различать сходные мишени, то есть когда патогенная мишень и непатогенная не-мишень формы различаются единственной детерминантой.
Этим объясняются многочисленные «перекрестные» положительные реакции, которые приводят к ошибочным диагнозам. Еще один серьезный недостаток: для получения антител каждый раз необходимо заново иммунизировать животных и очищать выделенную сыворотку. Это стоит немалых денег.
Благодаря разработке метода получения моноклональных антител МАТ с помощью техники гибридом стало возможно получение препаратов антител к одной антигенной детерминанте. Мильштейн и Г. Келер за разработку техники получения гибридом, вырабатывающих МАТ с запрограммированной специфичностью, получили в 1984 году Нобелевскую премию в области медицины и физиологии.
Они рассчитывали использовать гибридомы лишь для изучения генетики антител, а результат привел к подлинному буму. В основу метода положен давно известный принцип гибридизации слияния соматических, неполовых, клеток с последующим выделением и культивированием необходимого гибридного клона. Для слияния используют клетки двух видов.
Подготовка к анализу зависит от того, какой биологический материал вы сдаете. Если кровь, то особо готовиться не надо. Для других материалов есть несложные правила — если их соблюдать, анализ будет точнее. Если вам назначили качественный ПЦР-анализ, имеет смысл сдавать его или в государственной лаборатории если обследование положено по ОМС , или в частной, где окажутся подходящие цены. Если вам назначили количественный ПЦР-анализ, врач напишет в направлении не только название исследования, но и предпочтительный метод, которым нужно провести ПЦР-анализ.